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Tipi di filtri in Fluorescenza

L'elemento primario di filtraggio in un microscopio a epifluorescenza è l'insieme di tre filtri ospitato in un filter block o in una filter slide: il filtro di eccitazione, il filtro di emissione, e il beamsplitter dicroico.

Figura 7: set "ideale" di filtri per fluorescenza, tra cui un eccitatore, dicroico ed emettitore.
Un esempio di assorbimento (eccitazione) e di emissione con spettro sovrapposto.

Il filtro di eccitazione (chiamato anche eccitatore) trasmette solo quelle lunghezze d'onda della luce che eccitano efficientemente un colorante specifico (fluorocromo). Nel passato venivano utilizzati prevalentemente filtri di tipo "short-pass", oggi sono utilizzati quasi esclusivamente filtri di tipo "band-pass". Il filtro di emissione (filtro di sbarramento o emettitore) attenua tutta la luce trasmessa dal filtro di eccitazione e, in modo efficiente e selettivo, trasmette la fluorescenza emessa dal campione. Questa luce è sempre di lunghezza d'onda più lunga di quella di eccitazione. I filtri di emissione possono essere sia "band-pass" o "long-pass". Il beamsplitter di filtri dicroici è una sottile lamina di vetro rivestito fissato con un angolo di 45 gradi nel percorso ottico del microscopio. Questo rivestimento ha la capacità unica di riflettere una lunghezza d'onda, la luce di eccitazione, e trasmettere un'altra lunghezza d'onda, la fluorescenza emessa. Oggi, i filtri dicroici riescono a riflettere più del 90% della luce di eccitazione e a trasmettere circa il 90% della luce di emissione, rispetto ai precedenti grigi semiargentati a specchio che riflettevano e trasmettevano il 50% della luce arrivando ad un efficienza di solo il 25%.
Le caratteristiche spettrali di un particolare fluorocromo, possono essere sovrapposte con il profilo spettrale di un set di filtri per fluorescenza alfine di guidare nella scelta del set più appropriato di filtri per una determinata applicazione. La Figura 7 illustra il profilo spettrale di un set "ideale" di filtri utilizzati per eccitare un dato fluorocromo e catturare la luce emessa. Come si può vedere, il filtro di eccitazione trasmette la luce attraverso lo spettro di assorbimento, e il filtro di emissione trasmette una banda di lunghezze d'onda che attraversa il picco di emissione del fluorocromo. Il dicroico attenua la luce eccitazione e trasmette solo quella di emissione.

Ogni grande azienda costruttrice di Microscopi ha stabilito degli standards relativamente alle misure dei filtri utilizzati in Fluorescenza. La seguente tabella mostra in dettaglio le misure di ogni tipo di filtro (EXC, DICH, EMI) relativamente all’azienda costruttrice.