www.fluorescencemicroscopy.it

Contrasto di Fase

Il metodo della Microscopia a contrasto di fase è stato inventato da Frits Zernike (che ha ricevuto il Premio Nobel per questa invenzione), nel 1953. Il metodo consiste nell'aumentare il contrasto e rendere quindi visibili preparati trasparenti, incolori, che in questo modo possono differire dal loro mezzo circostante (ad esempio acqua, o il mezzo di montaggio), in quanto verranno a possedere un diverso indice di rifrazione. Usando la microscopia in campo chiaro, questi oggetti sarebbero quasi invisibili.
L'ottica a contrasto di fase di un microscopio è in grado di convertire le differenze nell'indice di rifrazione in una differenza di luminosità. L'effetto ottico che viene utilizzato consiste in uno sfasamento nel raggio di luce. Le onde, durante il loro passaggio attraverso i nuclei delle cellule, il citoplasma o l'acqua, vengono leggermente sfasate, perché questi mezzi hanno indici di rifrazione leggermente diversi. Dal momento che maggiore è l'indice di rifrazione di un mezzo, tanto minore è la velocità della luce nel mezzo stesso, un'onda luminosa che attraversa un nucleo di una cellula è in ritardo rispetto alle onde luminose che attraversano l'acqua circostante. L'ammontare di questo "ritardo" viene detto differenza di fase. Prima di attraversare il campione le onde sono "in fase" fra loro, ma non lo sono più dopo aver attraversato i diversi materiali. La lunghezza del percorso e la tipologia del mezzo determinano la grandezza relativa alla differenza di fase nella luce che ha attraversato il preparato.
Come sappiamo l'occhio umano non può vedere questi spostamenti di fase nell'immagine microscopica, a questo provvede il sistema ottico del microscopio a contrasto di fase che trasforma "il ritardo" di fase in livelli del grigio.
Il funzionamento di un microscopio a contrasto di fase è simile a quello in campo scuro, in questo caso lo "stop" nel porta filtri del condensatore è sostituito da un diaframma anulare. Un diaframma anulare della stessa ampiezza si trova nell'obiettivo che ha due scopi, attenua la luce diretta che proviene dal condensatore e introduce uno sfasamento supplementare in essa. Gli obiettivi utilizzati nel microscopio a contrasto di fase sono, quindi, obiettivi speciali, dotati di un anello di fase vicino alla pupilla. Sono riconoscibili perché vengono indicati con la sigla "Ph1", "Ph2" e "Ph3" a seconda del fattore di ingrandimento, in genere "Ph1" per ingrandimenti fino a 10x, "Ph2" per ingrandimenti fino a 40x, "Ph3" da 40x in poi. Questo tipo di obiettivi può essere utilizzato anche per le osservazioni in campo chiaro, con un leggerissimo calo della qualità dell'immagine.
Anche il condensatore sarà corredato di anelli di fase Ph1, Ph2 e Ph3 che dovranno essere utilizzati a seconda dell'obiettivo scelto.
Un operazione da effettuare con questa tecnica è il " centramento" dei diaframmi anulari nel condensatore, in modo che nel percorso ottico l'immagine del diaframma anulare coincida esattamente con la posizione dell'anello di fase. Di ausilio, per ottenere una centratura estremamente precisa, si utilizza un "oculare di fase" o una "lente di Bertrand", che vengono inserite nel tubo al posto dell'oculare stesso e servono unicamente per l'allineamento degli anelli di fase; la centratura nel condensatore si esegue per mezzo di due regolazioni poste ai lati dello stesso.
Un fenomeno da evidenziare perché fastidioso nel contrasto di fase sono gli aloni di luce che si formano ai bordi delle strutture. Essi sono causati da un effetto ottico e possono condurre alla "illeggibilità" dell'immagine, soprattutto con campioni di elevato spessore, dato che gli aloni si sovrappongono più volte. Per questo motivo, il contrasto di fase è consigliabile solo con oggetti molto sottili e possibilmente poco aggregati. Un metodo per limitare questo inconveniente è quello di utilizzare un filtro di interferenza verde che posizionato sopra il portalampada provvede ad attenuare il fenomeno.
A seconda del sistema utilizzato, i campioni saranno evidenziato come luminosi su sfondo scuro (contrasto di fase negativo) o scuri su uno sfondo luminoso (contrasto di fase positivo).
La Microscopia a contrasto di fase è comunemente usata per l'osservazione di batteri, protozoi,i microrganismi e di tutti quei soggetti che si intende osservare senza l'ausilio di una colorazione.