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Epi-Fluorescenza

Nella microscopia in epifluorescenza, l'illuminatore è posizionato tra l'oculare e l'obiettivo. L'illuminatore è progettato per dirigere la luce sul campione facendola transitare precedentemente attraverso l'obiettivo del microscopio, che in questa configurazione funziona da condensatore, e poi utilizzando lo stesso obiettivo per catturare la fluorescenza emessa. Il vantaggio di questa configurazione è che il componente obiettivo/condensatore sarà sempre in perfetto allineamento. La maggior parte della luce di eccitazione che raggiunge il campione passa senza nessun tipo di influenza e l'area illuminata corrisponderà all'area osservata.

Schema di un microscopio per microscopia in Epi- fluorescenza

L'illuminatore utilizza una lampada a scarica ad arco corto, in genere una lampada al mercurio o allo xeno, questo tipo di lampade vengono utilizzate perchè forniscono una forte intensità della luce in una superficie molto piccola, ideale per questo tipo di impiego. La luce di eccitazione viaggia lungo l'illuminatore perpendicolarmente all'asse ottico del microscopio, passa attraverso eventuali lenti (heat filter, infrarossi...) e infine nel diaframma. La luce attraversa il filtro di eccitazione che lascia passare solo la banda di frequenze desiderata e blocca le frequenze non volute. Le lunghezze d'onda desiderate, raggiungono, quindi, lo specchio dicroico, che è un filtro specializzato nel riflettere le lunghezze d'onda corte (di eccitazione) e nel far passare le lunghezze d'onda più lunghe. Questo filtro è posizionato a 45° rispetto alla luce di eccitazione e riflette questa luce a 90° attraverso il sistema ottico fino al campione. L'emissione prodotta dal campione illuminato è collimata dall'obiettivo. Siccome la luce emessa è di lunghezza d'onda maggiore della luce d'eccitazione, essa è capace di passare attraverso lo specchio dicroico, e giungere all'osservatore.
Una parte della luce di eccitazione che raggiunge lo specchio dicromatico è riflessa verso la sorgente luminosa, una piccola parte viene assorbita invece dal rivestimento interno dello specchio. Prima che la luce emessa per fluorescenza giunga all'occhio dell'osservatore essa deve prima passare il filtro di emissione. Il filtro blocca la luce di eccitazione e lascia passare le lunghezze d'onda desiderate.
Nei microscopi più moderni il filtro di eccitazione, lo specchio dicroico, e il filtro di emissione sono incorporati in un unico blocco denominato block filters.