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Illuminazione in Fluorescenza

In un microscopio a Fluorescenza possono essere utilizzati vari tipi di sorgenti per illuminazione, dalle classiche lampade al mercurio (HBO) o allo Xeno, alle più moderne Metal Halide, sino all' ultimo arrivato: il LED.
In questa sezione analizzeremo tutte queste soluzioni fornendo per ognuna i vantaggi e gli svantaggi unitamente alle caratteristiche peculiari del prodotto.
In generale possiamo dire che per generare una luce di eccitazione sufficientemente intensa alfine di produrre un'emissione atta all'osservazione, con questa tecnica, è necessario utilizzare delle sorgenti di luce compatte e potenti. Dall'inizio della microscopia in Fluorescenza, sono state utilizzate, per questo scopo, le lampade a scarica. Questo tipo di lampade, con potenza compresa tra 50 e 200 Watt (HBO), e da 75 a 150 Watt (XENO) vengono generalmente alimentate da un generatore di corrente, che fornisce una certa potenza all'accensione consentendo la vaporizzazione dei gas e facendo bruciare i vapori con una conseguente resa luminosa molto alta. L'alimentatore può essere fornito di timer che monitorizza il numero di ore di utilizzo del bruciatore. Questo perchè questo tipo di lampade dopo un certo periodo di utilizzo perde efficienza e deve essere sostituito, pena l'eventualità di scoppio se utilizzate al di sopra del loro tempo di vita stimato. Le lampade HBO non forniscono, però, un'emissione luminosa costante nello spettro luminoso compreso tra l'infrarosso e l'ultravioletto. Infatti la maggior parte dell'emissione si ha nel vicino ultravioletto. I picchi di intensità si hanno a 313, 334, 365, 405, 436, 546, e 577/9 nm. Ad altre lunghezze d'onda nella regione del visibile, l'intensità non è altrettanto forte ma è comunque utilizzabile in molte applicazioni della Fluorescenza. Quindi possiamo affermare che nel considerare l'efficienza luminosa di una sorgente, la potenza della lampada è solo uno dei fattori da considerare.
Primaria importanza riveste anche la distribuzione dell'intensità alle varie lunghezza d'onda, la geometria dall'arco e l'apertura angolare dell'emissione.

Caratteristiche della lunghezza di banda

Una delle variabili più importanti da considerare nella scelta di una fonte di illuminazione per la microscopia è la distribuzione spettrale o il profilo della lunghezza d'onda emessa dalla sorgente. Anche se la caratteristica delle fonti di luce artificiale e di alcune lampade ad arco è quella di produrre luce bianca che presenta abbastanza luminosità e uniformità in tutta la regione visibile della lunghezza d'onda, lo stesso, ad esempio, non vale per i LED, il laser, e alcune lampade ad arco (mercurio e ioduri metallici). Storicamente, i fluorocromi sono stati selezionati per l'uso in microscopia a fluorescenza perché sono specificamente eccitati dalle linee di maggiore intensità prodotte dalle lampade ad arco di mercurio. Questa strategia non serviva solo per aumentare la luminosità, ma anche per usufruire di larghezza di banda limitata nella progettazione di efficaci specchi bicromatici e sottili film necessari per filtri interferenziali. Inoltre, gli obiettivi dei microscopi in commercio erano spesso destinati a produrre un ottima correzione cromatica a queste lunghezze d'onda.
Anche le lampade allo xeno sono state e sono ancora molto utilizzate in Fluorescenza, queste, al contrario, non hanno i picchi nello spettro che si possono riscontrare nelle lampade al mercurio, ma sono forse ancora più utili perché il loro spettro continuo può essere efficacemente utilizzato per eccitare simultaneamente più fluorocromi
Al contrario, le linee di emissione dei LED di rado si uniformano a quelle delle lampade HBO, quindi, per utilizzare queste fonti di luce in Fluorescenza è necessaria una nuova valutazione di fluorocromi adatti e corrispondenti ai set di filtri oggi in commercio. Le grandi case di microscopia ottica stanno tuttora valutando, e in alcuni casi finalizzando, la possibilità di sostituire la vecchia tipologia di lampade ad arco con questa nuova tecnologia.
I profili spettrali delle varie fonti di luce comuni per microscopia ottica sono presentati nella figura sopra. I picchi distinti presenti negli spettri della lampada di mercurio e ioduri metallici si verificano a 365, 405, 436, 546, e 579 nanometri Alcune regioni dello spettro sono molto basse come quella tra 450nm e 530nm, l'eccitazione a queste lunghezze di banda è problematica.
Al contrario, invece, la lampada alogena mostra un ampio profilo spettrale che ha relativamente poca banda nelle lunghezze d'onda ultraviolette, ma aumenta gradualmente prima di assestarsi nella regione del vicino infrarosso. La potenza relativa della lampada è, però, di circa il 25 per cento della lampada al mercurio al centro della regione del visibile (550 nanometri: il profilo spettrale della lampada alogena è indicata a 10x come uscita effettiva), questo la rende appetibile per essere utilizzata per alcune tipi di fluorocromi (FITC). A differenza della lampada di mercurio, la lampada allo xeno ha un basso, ma continuo profilo di energia nella regione del visibile con la maggior parte di questa concentrata a lunghezze d'onda di 800 nanometri, questo è uno dei motivi perchè in alcuni casi, come la fluorescenza che utilizza filtri multibanda, le lampade allo xeno potrebbero essere la scelta migliore. Le lampade ad alogenuri metallici (Metal Halide) ad arco hanno funzionalità identiche come righe spettrali a quelle HBO, ma producono livelli di energia più continui tra le linee anche se con punte meno elevate, rendendole così più utili in caso di utilizzo con tutti quei fluorocromi che non necessitino di particolari picchi.

Proprietà ottiche e fisiche delle sorgenti

Tabella 1.

Tabella 2.

Nelle tabelle sopra viene descritto il confronto tra le proprietà ottiche e fisiche delle fonti di illuminazione più comuni per la microscopia ottica in Fluorescenza. La lampada a mercurio HBO da 100 watt ha la più alta luminosità (luminanza e media) delle lampade a qualsiasi livello di potenza comunemente impiegati nella microscopia, principalmente a causa della dimensione molto piccola della sorgente (arco). Per il microscopista, il contenuto spettrale della sorgente luminosa (di cui alla tabella sopra come irradianza spettrale), è una considerazione molto importante quando si confrontano le varie fonti di luce. Il flusso radiante definisce l' emissione di luce a tutte le lunghezze d'onda e non fornisce informazioni sulla sua distribuzione spettrale (in effetti, il numero e l'intensità delle diverse lunghezze d'onda effettivamente emesso). Questo è particolarmente evidente quando le unità fotometriche, come la luminanza media, sono utilizzate per il confronto delle varie fonti. Poiché le unità fotometriche sono ponderate in funzione della limitata sensibilità spettrale dell'occhio umano, la banda nell' ultravioletto e nell'infrarosso ha un fattore di rilevanza molto piccola rispetto a quella della luce verde (al centro della curva di risposta dell'occhio umano). Il confronto tra il flusso radiante o luminoso di fonti di luce policromatica e monocromatica (come i laser e LED) non sono significativi, se solo una porzione limitata dello spettro può essere utilizzato da queste sorgenti.
Le fonti di illuminazione basate su scarica di plasma (lampade ad arco), incandescenza (lampade alogene), o l'emissione stimolata in un ambiente gassoso (laser a gas) richiedono un periodo di tempo considerevole dopo l'accensione per raggiungere l'equilibrio termico, un fattore che può influenzare attività cha hanno nel tempo, nello spazio e nella stabilità elementi importanti di riuscita. Tutte le lampade che producono un livello significativo di calore, compresi diodi emettitori di luce, inoltre presentano una dipendenza della produzione di emissioni sulla temperatura della sorgente. In molti casi, un periodo massimo di un'ora è necessaria fino a quando la sorgente di illuminazione è sufficientemente stabile da consentire misurazioni riproducibili o di registrare sequenze video in time-lapse, senza significative variazioni temporali di intensità. Una volta che la corretta temperatura di funzionamento è stata raggiunta, la lampada alogena è la più stabile fonte di luce convenzionale in periodi di tempo di pochi millisecondi a causa dell'inerzia termica del filamento di tungsteno. I LED ( light-emitting diode) sono in grado di reagire, invece, molto rapidamente (entro pochi microsecondi), ma, in caso di utilizzo alla massima, potenza possono anche generare una quantità significativa di calore durante il warm-up e, a causa della loro alta velocità, sono interessati da instabilità dell'alimentatore alle alte frequenze. In generale, si può affermare, che le lampade a scarica ad arco sono le fonti di illuminazione più instabili attualmente in uso in microscopia ottica. Oltre al fatto che lo sfarfallamento dell'arco peggiora con l'età, la potenza luminosa può inoltre essere influenzata dai campi elettromagnetici dell'ambiente o da un alimentatore instabile.

Le nuove tecnologie : LED

Il LED è un semiconduttore compatto che emette luce incoerente in uno spettro ristretto quando viene alimentato. Il colore della luce emessa dipende dalla composizione e dalle condizioni del materiale semiconduttore utilizzato, e può essere vicino-ultravioletto, visibile, o infrarossi. La tecnologia LED si è notevolmente evoluta negli ultimi anni, quando i primi LED commerciali vennero introdotti nel 1968 erano in grado di fornire solo 0,001 lumen di luce rossa, un livello di luminosità adatto solo per essere utilizzati come indicatori. Nel corso degli ultimi quattro decenni, la tecnologia LED è avanzata ad un ritmo rapido, comparabile al tasso di avanzamento dei microprocessori.
Ora che i LED forniscono sufficiente intensità alle lunghezze d'onda specifiche necessarie, la microscopia a fluorescenza è in grado di sfruttarne appieno i vantaggi, tra cui: le dimensioni compatte, basso consumo energetico, produzione minima di calore, velocità di commutazione, stabilità estremamente elevata dell'emissione, lunga durata di vita. Unico neo: la potenza limitata. A tutt'oggi, infatti, il LED con potenza più elevata, 5W, non fornisce ancora una resa luminosa pari a quella di una lampada HBO 50W o XBO 75W. Ovviamente parliamo di LED singoli e non di "chip",ovvero matrici di LED, che possiedono sì una resa luminosa molto più alta ma in una quantità di spazio più ampia e quindi non adatta all'illuminazione in microscopia. La tecnologia LED dà la possibilità di scegliere la lunghezza d'onda di eccitazione più adatta per ogni fluorocromo utilizzato. In pratica, utilizzando questa sorgente di luce potremo fare a meno del filtro di eccitazione anche se, non sempre è possibile o consigliabile attuare questo tipo di scelta.
Attualmente sono disponibili un certo numero di lunghezze d'onda, che vanno dai raggi ultravioletti (365 nanometri) ai raggi infrarossi (superiori a 800 nanometri, vedi figura sopra). L'unica differenza significativa in termini di microscopia a fluorescenza è la regione verde-giallo tra 530 e 580 nanometri, ma i LED che emettono in questa lunghezza d'onda critica dovrebbero essere disponibili a breve. Da notare che test con LED bianchi, (cold light) hanno evidenziato una risposta nello spettro simile a quella di un Led Blu. La larghezza spettrale (larghezza a metà altezza, FWHM) di un tipico LED quasi-monocromatico varia da 20 a 40 nanometri, che è simile alla larghezza della banda di eccitazione di molti fluorocromi. Rispetto alla luce laser, la larghezza di banda più ampia del LED è più utile per l'eccitazione di fluorocromi. Inoltre, rispetto allo spettro continuo di lampade ad arco, i LED sono più freddi, più piccoli, e forniscono un meccanismo più conveniente per scegliere più lunghezze d'onda con commutazione rapida. Le principali case di filtri per fluorescenza, stanno completando l'accoppiamento filtri di eccitazione - LED, che servirà ad eliminare le code ai bordi del profilo della lunghezza d'onda di emissione. Ovviamente per utilizzare questo tipo di illuminazione in microscopia, occorre servirsi di una sorgente che fornisca la possibilità di cambiare tipologia di LED in modo veloce e automatico. A tale scopo sono stati già realizzati dalle case di microscopia varie soluzioni, che, anche se a costi elevati, offrono alternative adatte allo scopo. Un esempio dell'impiego dei LED in microscopia è il sistema modulare Colibri, fornito da Carl Zeiss MicroImaging. Questo sistema utilizza dieci diversi moduli LED con colori dall'UV al rosso scuro: i moduli emettono lunghezze d'onda di 365, 380, 400, 455, 470, 505 530, 590, 615 e 625 nanometri. I moduli possono essere gestiti a seconda della banda che si vuole utilizzare, l'intensità di ogni modulo può essere regolata in modo indipendente.

Caratteristiche delle lampade HBO OSRAM