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COLORAZIONE MULTIPLA DI FLUOROCROMI E SOVRAPPOSIZIONE DI BANDA

Quando un campione viene analizzato con più fluorocromi, esiste una elevata probabilità di sovrapposizione degli spettri di emissione. Cioè, la fluorescenza di un colorante può passare attraverso il filtro per le emissioni dell'altro colorante. Un esempio comune è la sovrapposizione di emissione di due fluorocromi comuni come Fluoresceina e Texas Red.

Figura 5. La sovrapposizione dello spettro di emissione nelle "code" di fluoresceina (A) e Texas Red (B) richiede l'uso di filtri di emissione selettivi separati.



FILTRI DI EMISSIONE LONG PASS
Un set "standard" di filtri per Fluoresceina include un filtro "Long Pass" come emissione (o barriera) (Figura 6). Questo filtro trasmette la fluorescenza indotta da fluoresceina, ma potrebbe anche passare la fluorescenza rossa indotta da Texas Red. Il "bleedthrough" risultante potrebbe confondere l'interpretazione.

Figura 6. Set di filtri base per Rhodamine (Chroma Corp). Il filtro di emissione (A) è un filtro long-pass che trasmette tutte le lunghezze d'onda oltre i 590 nm.



FILTRI DI EMISSIONE BAND PASS
Un set più appropriato per la visualizzazione della Fluoresceina è quello che ha un filtro Band Pass al posto del LP mostrato in Figura 6. La figura 7 mostra lo spettro di un insieme di filtri più discriminante per la Fluoresceina. Il filtro Band-Pass trasmette la fluorescenza verde della Fluoresceina, ma blocca le lunghezza d'onda di emissione degli altri (rosso) coloranti fluorescenti come Texas Red, o l'emissione da autofluorescenza.

Figure 7. Set di filtri per Fluoresceina/GFP con un filtro di tipo Band-Pass. Il filtro di emissione trasmette una considerevole porzione di banda (A).



SET DI FILTRI A LUNGHEZZA D'ONDA MULTIPLA
Oltre alla sovrapposizione delle lunghezze d'onda, la visualizzazione di più fluorocromi introduce un altro problema. Ogni set di filtri è composto da tre elementi in vetro individuali e sei superfici di rifrazione. I campioni visualizzati tramite un set di filtri, quindi, producono una immagine rifratta che è quasi sempre decentrata rispetto a un'immagine dello stesso campione ma attraverso un diverso filter-block. E ' quasi impossibile, quindi mantenere la corretta riproduzione delle immagini durante un eventuale “merge” delle stesse o effettuare diverse riprese di un campione quando si utilizzano due o più filter-cube. L'interpretazione della localizzazione dei fluorocromi è molto ambigua in queste condizioni sperimentali.Una semplice soluzione a questo problema è attraverso l'utilizzo di set di filtri a lunghezza d'onda multipla. Questi sets sono costituiti sempre da tre filtri, tuttavia, invece di passare una di lunghezza d'onda fissa, questi sets ne trasmettono due o più (Figura 8). Poiché la fluorescenza di ciascun fluorocromo attraversa lo stesso filtro, la registrazione viene mantenuta correttamente per ogni singola ripresa e la localizzazione del fluorocromo può essere interpretata correttamente.

Figure 8. Set di filtri a lunghezza d'onda multipla per Fluoresceina and Rhodamine. Due picchi di eccitazione eccitano Fluoresceina and Rhodamine. Due picchi di emissione trasmettono fluorescenza da queste due famiglie di fluorocromi.