www.fluorescencemicroscopy.it

Intensità del segnale di fluorescenza

Diversi fattori influenzano la quantità di fluorescenza emessa da un campione trattato con una determinata quantità di fluorocromo. Questi includono:

• La concentrazione di fluorocromo nelle sezioni del campione;
• lo spessore del campione;
• il coefficiente di estinzione del colorante;
• l'efficienza quantica del colorante;
• la quantità di materiale colorato effettivamente presente nel campo visivo del microscopio.

La concentrazione del fluorocromo nel campione è determinata da un corretto utilizzo del fluorocromo nelle operazioni di "marcatura" del campione stesso. Una maggiore quantità di materiale colorante, infatti, non sempre determina un miglior risultato per quanto riguarda l' emissione di fluorescenza da parte del preparato, anzi, spesso questo è causa di fenomeni come perdita di contrasto e introduzione di "artefatti" nel preparato.

Lo spessore del campione è fondamentale per il successo nell'analisi di un soggetto analizzato con la tecnica della fluorescenza. Campioni troppo spessi, infatti, trattengono maggiori quantità di fluorocromo portando a fenomeni come quelli sopra descritti. Campioni troppo sottili, al contrario, non permettono al colorante di "marcare" in modo ottimale il soggetto da esaminare, conseguenza di ciò è una debole o quasi nulla emissione di fluorescenza.

Il coefficiente di estinzione ci dice la quantità di luce che viene assorbita da un dato fluorocromo e riflette le caratteristiche di assorbimento, dipendenti dalla lunghezza d'onda, indicate dallo spettro di eccitazione del fluorocromo. L'emissione aumenta con un assorbimento maggiore di luce incidente, il che significa che fluorocromi con coefficienti di estinzione maggiore tendono a emettere più intensamente, e richiedono meno energia per eccitare adeguatamente il campione. Anche se molti fluorocromi hanno alti coefficienti di estinzione alle lunghezze d'onda di eccitazione di punta, le tecniche di preparazione dei campioni spesso limitano la concentrazione massima consentita nel campione, riducendo così la quantità complessiva di luce effettivamente assorbita dal campione marcato. Sperimentalmente, il vantaggio dei fluorocromi con un alto coefficiente di estinzione è la capacità di usare quantità ragionevole di luce di eccitazione, evitando i processi negativi come "fading" e "photobleaching".

L'efficienza quantica, che è il rapporto tra energia luminosa assorbita e fluorescenza emessa, determina la quantità di questa energia luminosa che verrà convertita in fluorescenza. I fluorocromi più comunemente usati oggi hanno una efficienza quantica di circa 0,3-0,6, ma il valore effettivo può essere ridotto dal fenomeno di "quenching".

Il prodotto di questi fattori, in aggiunta al fatto che molti preparati hanno quantità molto piccole di materiale marcato nel campo di vista osservato, dà il rapporto dell' intensità di fluorescenza emessa per l'intensità della luce di eccitazione, tra 1 / 10000 e 1 / 1000000. Le tecniche attuali (fluorescenza ad esempio di ibridazione in situ), che utilizzano piccole quantità di materiale fluorescente, potrebbero avere rapporti più bassi (1/1000000000 o 1/0000000000). Così, per ottenere un immagine fluorescente con un contrasto adeguato, il microscopio a fluorescenza deve essere in grado di attenuare la luce di eccitazione fino ad 1/100000000000 (per fluorescenza molto debole) senza diminuire il segnale di fluorescenza. L'utilizzo di filtri ottici appropriati, unitamente ad una corretta configurazione intrinseca del microscopio a fluorescenza, rappresentano una componente essenziale che contribuisce enormemente a tale processo di filtraggio.