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Fading, quenching, e photobleaching

Un ampio spettro di condizioni e di fattori spesso entrano in gioco per compromettere i fenomeni di eccitazione ed emissione della Fluorescenza e quindi ridurne l'intensità.
Il termine generale per una riduzione dell'intensità di fluorescenza è fading, termine che raccoglie i fenomeni di quenching e photobleaching.
I due fenomeni sono distinti per il fatto che il quenching è spesso reversibile mentre il photobleaching non lo è
Per photobleaching si intende la decomposizione irreversibile delle molecole fluorescenti nello stato eccitato a causa della loro interazione con molecole di ossigeno prima del processo di emissione.
Il tasso di photobleaching dipende da diversi fattori, tra cui la reattività chimica del fluorocromo, l'ambiente chimico intracellulare, l'intensità e la lunghezza d'onda della luce di eccitazione. Alcuni coloranti fluorescenti sono facilmente suscettibili di photobleaching mentre altri sono relativamente stabili. In alcuni casi, il campione può riprendersi dagli effetti di photobleaching, soprattutto se viene mantenuto al fresco e in un ambiente buio. Il fenomeno di photobleaching può essere minimizzato riducendo i tempi di esposizione o riducendo l'energia di eccitazione (intensità della lampada); possono essere inseriti, allo scopo, dei filtri a densità neutra nel percorso della luce prima che questa raggiunga il filtro di eccitazione, diminuendo così l'intensità della luce stessa. Tuttavia questi rimedi sono accompagnati dall'effetto indesiderato di ridurre anche l'intensità di emissione del fluorocromo. E' anche utile, ove possibile, l'utilizzo di specifiche sostanze "antifade" , attualmente disponibili in commercio. Il fenomeno di fading può anche essere ridotto, in alcuni casi, modificando la concentrazione del pH del mezzo di montaggio. Un altro metodo è l'incremento della concentrazione del fluorocromo o l'utilizzo di fluorocromi più appropriati meno suscettibili al photobleaching.
Il verificarsi di photobleaching viene sfruttato in una tecnica nota come il recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP), un meccanismo molto utile per indagare la diffusione e il movimento delle macromolecole biologiche. Il metodo si basa sul photobleaching di una regione ben definita del campione esposta ad un'intensa luce laser. Successivamente vengono analizzati i tassi e le modalità di recupero di fluorescenza nell'area interessata. Una tecnica correlata, nota come la perdita di fluorescenza in photobleaching (FLIP), è impiegata per monitorare la diminuzione della fluorescenza in una regione adiacente a quella dove si è verificato il photobleaching. Simile al FRAP, quest'ultima tecnica è utile per lo studio della mobilità molecolare e nelle dinamiche delle cellule viventi.

Il fenomeno di photobleaching deve essere distinto da un altro artefatto della Fluorescenza, il quenching, che avviene attraverso la riduzione (o in alcuni casi, il potenziamento) della intensità della fluorescenza a causa di processi concorrenti come la temperatura, alte concentrazioni di ossigeno, e l'aggregazione molecolare in presenza di sali o composti alogeni. Un esempio comune di quenching è osservato tramite collisione di un fluorocromo allo stato di eccitazione con un'altra molecola in soluzione (non fluorescente); il risultato è la disattivazione del fluorocromo e il ritorno allo stato fondamentale. Nella maggior parte dei casi, nessuna delle molecole è chimicamente modificata nel processo di quenching dovuto a collisione. La maggior parte dei processi di quenching intervengono riducendo la durata dello stato eccitato e la resa quantica del fluorocromo.
A volte il quenching è il risultato di trasferimento di energia ad altre molecole accettori che risiedono fisicamente vicino al fluorocromo eccitato, un fenomeno noto come trasferimento di energia di risonanza. Questo particolare fenomeno è diventato la base per una tecnica più recente di misurare le distanze molto al di sotto della risoluzione laterale del microscopio ottico (FRET). Anche le impurità dei fluorocromi possono contribuire a ridurre l'intensità della fluorescenza causando photobleaching o quencing.

Nella figura sopra viene presentato un tipico esempio di photobleaching (fading) osservato in una serie di immagini digitali catturate in momenti diversi relativi ad una cultura di cellule.
I nuclei sono stati colorati con DAPI (fluorescenza blu), mentre il citoscheletro di actina e i mitocondri sono stati colorati rispettivamente con MitoTracker Rosso (fluorescenza rossa) e Alexa Fluor 488 (fluorescenza verde). Le foto sono state prese a intervalli di due minuti con una combinazione di filtri a fluorescenza con larghezze di banda selezionate per eccitare i tre i fluorocromi contemporaneamente (filtri triband). Notare che tutti e tre i fluorocromi hanno una intensità relativamente elevata nel quadro (a), ma l'intensità relativa a DAPI (blu) inizia a calare rapidamente a due minuti ed è quasi completamente esaurita in sei minuti. Le macchie mitocondriali e l'actina sono più resistenti al photobleaching, ma l'intensità di entrambe si attenua notevolmente nel corso della sequenza temporale (10 minuti). La registrazione di eventi di fluorescenza, in tale contesto, diventa problematica, una soluzione per limitare l'inconveniente è aumentare la sensibilità di rilevazione del mezzo di ripresa, utilizzando fotocamere digitali con "low-light level" CCD progettate specificamente per la microscopia a fluorescenza.