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Fluorescenza

Alcuni materiali eccitati da luce a bassa lunghezza d'onda emettono luce a lunghezza d'onda più alta. Questo fenomeno è chiamato Fluorescenza. La Fluorescenza si distingue in primaria e secondaria. Se una sostanza emette flurescenza autonomamente, dopo essere stata eccitata da una luce ad una determinata lunghezza d'onda, si parla di fluorescenza primaria; una delle sostanze che emettono fluorescenza primaria è la clorofilla. Più spesso si tratta di fluorescenza indotta o secondaria cioè ottenuta con un particolare tipo di colorazione istologica chiamato "fluorocromo" che è utilizzato per "marcare" il materiale specifico da analizzare.
La sorgente di luce utilizzata per irradiare il preparato è ad alta energia ( lampade HBO o XENO) e a lunghezza d'onda corta (es. UV o blu), la luce emessa è a bassa energia e a lunghezza d'onda maggiore (es. verde o rosso) secondo la legge di Stokes.
Nei fenomeni di fluorescenza l'intensità dell'emissione luminosa è specifica per ogni sostanza e diminuisce nel tempo molto rapidamente, con una legge esponenziale analoga a quella del decadimento radioattivo; in pratica si può dire che la fluorescenza, a differenza della fosforescenza, cessa al cessare della causa di eccitazione.
Per visualizzare il fenomeno della Fluorescenza occorre un particolare tipo di microscopio: il microscopio a Fluorescenza.
Il microscopio a fluorescenza è stato sviluppato da Köhler, Rechert e Lehman all'inizio del 20° secolo, ma solo dopo alcune decadi è stato possibile vederne la piena realizzazione.
In questo tipo di microscopio viene inserito nel percorso ottico un sistema di filtri, eccitazione, dicroico e sbarramento.
I filtri di eccitazione permettono di illuminare il campione con lunghezze d'onda selezionate provenienti dalla sorgente luminosa. I filtri di sbarramento sono scelti per bloccare (assorbire) le lunghezze d'onda di eccitazione e permettono di far passare solo le lunghezze d'onda emesse dal campione.
Gli specchi dicroici sono filtri specializzati disegnati per riflettere efficientemente lunghezze d'onda di eccitazione e lasciar passare lunghezze d'onda di emissione.
La scelta corretta di questi filtri è fondamentale nella microscopia a fluorescenza.
Esistono due tipi di microscopia in Fluorescenza, per luce trasmessa o per luce incidente.
Nelle pagine seguenti entrambe le tecniche verranno descritte in dettaglio.