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I Fluorocromi

Fluorescenza


I Fluorocromi





IIl fluorocromo Ŕ uno dei componenti essenziali per la microscopia in Fluorescenza. La scelta del tipo di fluorocromo da utilizzare Ŕ fondamentale per il campione che si vuole analizzare e per i risultati che si otterranno. La particolaritÓ di questa sostanza Ŕ quella di assorbire fotoni di una certa lunghezza d'onda e come effetto esibire fluorescenza. Gli elettroni passando dallo stato di eccitazione allo stato di riposo perdono energia. Conseguenza di questa perdita Ŕ lo spostamento dello spettro di emissione dei fluorocromi verso lunghezze d'onda pi¨ lunghe rispetto allo spettro di assorbimento (eccitazione). Si noti che la lunghezza d'onda varia inversamente all'energia della radiazione. Questo fenomeno Ŕ conosciuto come legge di Stokes o shift di Stokes. La dimensione dello "shift" varia con la struttura molecolare, ma pu˛ variare da pochi nanometri a oltre diverse centinaia di nanometri. Ad esempio, lo shift di Stokes per la Fluoresceina Ŕ di circa 20 nanometri, mentre per HOECHST 33258 Ŕ di 120 nanometri e quella per Acridine Orange (+RNA) Ŕ di circa 200 nanometri. L'utilizzo di filtri ottimali permette di aumentare il valore dello shift e, conseguentemente, di separare pi¨ facilmente la luce d'eccitazione.
La curva che rappresenta l'emissione, nello spettro, dei fluorocromi Ŕ usualmente pi¨ bassa o uguale in intensitÓ rispetto alla curva di eccitazione. Nel grafico di rappresentazione le due curve hanno una forma quasi speculare. Ad esempio si vedano le curve del fluorocromo FITC nella figura sotto, che assorbe nella regione del blu-verde e produce un'emissione verde-gialla. Per ottenere il massimo dell'efficienza luminosa, i fluorocromi sono generalmente eccitati al picco di assorbimento. La selezione delle lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione avviene mediante filtri ad interferenza. Inoltre la risposta spettrale del sistema ottico Ŕ anche dipendente da altri fattori come l'efficienza di trasmissione delle lenti, dalla potenza e tipologia della sorgente di luce, dal tipo di fluorocromo utilizzato







Esistono diversi tipi di fluorocromi, caratterizzati da diversi spettri di assorbimento e di emissione.
Il fluorocromo pu˛ essere acquistato in polvere o in soluzione, in entrambi i casi deve essere diluito in acqua o PBS, questi prodotti sono soggetti a decadimento, quindi occorre creare una soluzione madre che deve essere mantenuta al buio e a bassa temperatura, creando di volta in volta la soluzione che dovrÓ essere utilizzata al momento.

La tabella seguente vuole dare un indicazione sull'utilizzo dei vari fluorocromi in microscopia in Fluorescenza.
Viene indicato per ogni fluorocromo la banda di eccitazione ed emissione, tipo e modi per l'eventuale soluzione, il tempo di colorazione, i campi di applicazione.


FLUOROCROMO

EXC

EMIT

Tipo di soluzione

Tempo di colorazione

APPLICAZIONE

HOECHST 3258

346

460

buffer/water

10-30 m. (bacteria)
20-30 m. (live cells)
1-15 m. (fixed cells)

Marcatura DNA, cromosomi e nuclei. Colorazione di
cellule umane, animali e vegetali.

Acridyne Orange
(+RNA)

460

650

tampone fosfato
Ph 6.2

3 min

Differenzazione DNA e RNA
Microrganismi non fissati , colorazioni vitali

BO (Thiazole Yellow)

460

480

 

3 min.

DNA

BOBO-1

462

481

 

30 min. (< at high concentration)

DNA

Dye 307

485

590

anionic detergent contining buffer

5 min.

Colorazione di proteine in soluzione, membrane di cellule vive o fissate

Nile Red
(Phenoxazone 9)

485

525

 

5 min.

Lipidi intracellulari, parte idrofobica delle proteine, colorazioni di inclusioni di fosfolipidi lisosomiali

Fluorescein
(FITC)

494

518

buffer Ph 9

30 min.

Marcatura delle proteine e acidi nucleici

Carboxyfluorescein

492

518

buffer Ph 8

15 min.

Colorante non fluorescente, amminico-reattivo per l'analisi a lungo termine, generazione e proliferazione delle cellule

Acridyne Orange (+DNA)

500

526

tampone fosfato
Ph 6.2

3 min.

Differenzazione di DNA e RNA
Microrganismi non fissati , colorazioni vitali

Rhodamine G

502

527

     

TOTO-1

509

533

 

1 hour (< at high concentration)

Cellule vegetali
DNA

Thiazole Orange

509

530

buffer Ph 7

3 min.

Analisi dei reticolociti
Cellule vegetali

Heptyl-thiazole Orange

515

535

   

Cellule vegetali

N-desmethyl- thiazole Orange

515

535

   

Cellule vegetali

Carboxyeosin

515

542

buffer Ph 9

15 min.

Indicatore PH per range acidi, marcatore di ammine modificate e proteine coniugate

EOSIN

524

544

Ph 7

3-5 min.

Istologia - Colorazione del citoplasma

Erythrosin

529

544

Ph 7

3-5 min.

Istologia - Colorazione del citoplasma

Rhodamine B

555

580

 

15 min.

Colorazione di micobatteri - Strisci batterici

Carboxyrhodamine B

556

581

buffer Ph 9

   

P2 (Pyrillium)

580

640

 

5 min.

 



La tabella seguente indica i risultati ottenuti mediante l'utilizzo di diversi set di filtri per ogni preparato. Per ogni test effettuato viene indicata la tipologia del set (Dualband o single band), la banda di eccitazione e di emissione del filtro, il risultato ottenuto sui vari componenti e non della cellula presa in esame. Sono stati presi in considerazione alcune delle principali parti costitutive della cellula, e, comunque quelle che fornivano maggiori garanzie di marcatura: nucleo, citoplasma, mitocondri, lisosomi, centrosomi, microtubuli, actina. Fanno parte del test, come componenti esterni, i batteri. Il colore evidenziato nella descrizione del componente Ŕ quello ottenuto dal componente stesso nella fase del test. Il valore assegnato, indica quanto Ŕ risultato appropriato l'utilizzo di quel set di filtri su quel tipo di campione e utilizzando quel determinato fluorocromo. Il valore pi¨ alto indica il miglior risultato.


FLUOROCROMO

EXC

EMIT

RISULTATO DEI TEST SU CELLULE EPITELIALI UMANE IN BASE AL SET DI FILTRI USATI

HOECHST 3258

346

460

B/R = Nucleo, Lisosomi, Citoplasma, Microtubuli, Batteri, R=5
DAPI = Nucleo, Nucleolo, Lisosomi, Citoplasma, Microtubuli, Mitocondri, Batteri, R=4

Acridine Orange (+RNA)

460

650

G/R => Nucleo , Lisosomi, Citoplasma, Microtubuli, Batteri, R=5
FITC => Nucleo, Lisosomi, Citoplasma, Microtubuli, Batteri, R=2
TRITC => Nucleo, Citoplasma, Centrosomi, Batteri, R=4

BO (Thiazole Yellow)

460

480

G/R => Nucleo, Lisosomi, Citoplasma, Batteri, R=5

BOBO-1

462

481

G/R => Nucleo, Lisosomi, Citoplasma, Centrosomi, Microtubuli, Batter, R=5
B/R => Nucleo, Lisosomi, Citoplasma, Centrosomi, Batteri, R=5
TRITC => Nucleo, Citoplasma, Microtubuli, Vacuoli, R=3

Dye 307

485

590

G/R => Nucleo, Lisosomi, Citoplasma, Centrosomi, Microtubuli, Batteri, R=4
FITC => Nucleo, Citoplasma, Vacuoli, Mitocondri, Batteri, R=4

Nile Red (Phenoxazone 9)

485

525

G/R => Nucleo,Vacuoli, Citoplasma, Mitocondri, R=3
B/R => Nucleo,Vacuoli, Citoplasma, Mitocondri, R=2
FITC => Nucleo, Vacuoli, Citoplasma, R=2
TRITC => Nucleo, Citoplasma, Mitocondri, Vacuoli, R=3

Fluorescein (FITC)

494

518

FITC => Nucleo, Citoplasma, Vacuoli, Actina, R=3

Carboxyfluorescein

492

518

 

Acridyne Orange (+DNA)

500

526

G/R => Nucleo, Lisosomi, Citoplasma, Microtubuli, Batteri, R=5
FITC => Nucleo, Lisosomi, Citoplasma, Microtubuli, Batteri, R=2
TRITC => Nucleo, Citoplasma, Centrosomi, Batteri, R=4

Rhodamine G

502

527

 

TOTO-1

509

533

G/R => Nucleo, Lisosomi, Citoplasma, Centrosomi, Microtubuli, Batteri, R=5
FITC => Nucleo, Citoplasma, Microtubuli, Batteri, R=3

Thiazole Orange

509

530

G/R => Nucleo, Lisosomi , Citoplasma, Centrosomi, Microtubuli, Batteri, R=4
FITC => Nucleo, Citoplasma, Centrosomi, Microtubuli, Batteri, R=3

Heptyl-thiazole Orange

515

535

 

N-desmethyl- thiazole Orange

515

535

 

Carboxyeosin

515

542

 

EOSIN

524

544

G/R => Nucleo, Mitocondri, Citoplasma, Microtubuli, R=3
B/R => Nucleo,Vacuoli, Citoplasma, Mitocondri, R=2

Erythrosin

529

544

G/R => Nucleo,Vacuoli, Citoplasma, R=2
B/R =>Nucleo,Vacuoli, Citoplasma, R=2
TRITC
=> Nucleo,Vacuoli, Citoplasma, R=3

Rhodamine B

555

580

 

Carboxyrhodamine B

556

581

 

P2 (Pyrillium)

580

640

G/R => Nucleo, Lisosomi, Citoplasma, Centrosomi, Microtubuli, Batteri , R=4
B/R => Nucleo, Lisosomi ,, Citoplasma, R=2

G/R Dualband ..................B/R Dualband...............DAPI...............................FITC...............................TRITC
EXC 490 EMI 528...............EXC 390 EMI 470...........EXC 330 EMI 450................EXC 485 EMI 535................EXC 535 EMI 590
EXC 577 EMI 633...............EXC 520 EMI 590








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