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I Fluorocromi

IIl fluorocromo è uno dei componenti essenziali per la microscopia in Fluorescenza. La scelta del tipo di fluorocromo da utilizzare è fondamentale per il campione che si vuole analizzare e per i risultati che si otterranno. La particolarità di questa sostanza è quella di assorbire fotoni di una certa lunghezza d'onda e come effetto esibire fluorescenza. Gli elettroni passando dallo stato di eccitazione allo stato di riposo perdono energia. Conseguenza di questa perdita è lo spostamento dello spettro di emissione dei fluorocromi verso lunghezze d'onda più lunghe rispetto allo spettro di assorbimento (eccitazione). Si noti che la lunghezza d'onda varia inversamente all'energia della radiazione. Questo fenomeno è conosciuto come legge di Stokes o shift di Stokes. La dimensione dello "shift" varia con la struttura molecolare, ma può variare da pochi nanometri a oltre diverse centinaia di nanometri. Ad esempio, lo shift di Stokes per la Fluoresceina è di circa 20 nanometri, mentre per HOECHST 33258 è di 120 nanometri e quella per Acridine Orange (+RNA) è di circa 200 nanometri. L'utilizzo di filtri ottimali permette di aumentare il valore dello shift e, conseguentemente, di separare più facilmente la luce d'eccitazione.
La curva che rappresenta l'emissione, nello spettro, dei fluorocromi è usualmente più bassa o uguale in intensità rispetto alla curva di eccitazione. Nel grafico di rappresentazione le due curve hanno una forma quasi speculare. Ad esempio si vedano le curve del fluorocromo FITC nella figura sotto, che assorbe nella regione del blu-verde e produce un'emissione verde-gialla. Per ottenere il massimo dell'efficienza luminosa, i fluorocromi sono generalmente eccitati al picco di assorbimento. La selezione delle lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione avviene mediante filtri ad interferenza. Inoltre la risposta spettrale del sistema ottico è anche dipendente da altri fattori come l'efficienza di trasmissione delle lenti, dalla potenza e tipologia della sorgente di luce, dal tipo di fluorocromo utilizzato

Esistono diversi tipi di fluorocromi, caratterizzati da diversi spettri di assorbimento e di emissione.
Il fluorocromo può essere acquistato in polvere o in soluzione, in entrambi i casi deve essere diluito in acqua o PBS, questi prodotti sono soggetti a decadimento, quindi occorre creare una soluzione madre che deve essere mantenuta al buio e a bassa temperatura, creando di volta in volta la soluzione che dovrà essere utilizzata al momento.

La tabella seguente vuole dare un indicazione sull'utilizzo dei vari fluorocromi in microscopia in Fluorescenza.
Viene indicato per ogni fluorocromo la banda di eccitazione ed emissione, tipo e modi per l'eventuale soluzione, il tempo di colorazione, i campi di applicazione.