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Microscopia in Fluorescenza a luce trasmessa

La microscopia a fluorescenza in luce trasmessa (Diascopia) prevede l' illuminazione del campione dal basso. Il percorso ottico, in questo caso, è quello consueto nei microscopi comuni, con la lampada in basso e la luce focalizzata sul campione attraverso il condensatore. Un filtro di eccitazione, per selezionare le lunghezze d'onda volute, viene posto nel portalampada del microscopio, un filtro di sbarramento (barrier filter) o secondario viene posizionato sopra il revolver del microscopio per bloccare la luce residua di eccitazione e per selezionare la lunghezza d'onda giusta che raggiungerà l'occhio dell'osservatore o la camera da ripresa.
Il campione è eccitato dalla luce che passa attraverso il filtro primario e l'emissione fluorescente è catturata dalla lente dell'obiettivo, prima di arrivare all'oculare questa viene filtrata e, quindi, selezionata dal filtro secondario. Questa modalità elimina la necessità di specchi dicromatici.
La fluorescenza a luce trasmessa o fluorescenza diascopica, è nata prima dell' Epi-Fluorescenza, ma oggi è stata in gran parte abbandonata a causa di due grossi inconvenienti. In primo luogo, la luce di eccitazione che proviene dal condensatore ottico e passa attraverso la lente obiettivo non può essere completamente bloccata dal filtro di emissione, ciò causa, conseguentemente, un rumore di fondo elevato. Inoltre, l'allineamento ottico e la congruenza della lente condensatrice e la lente obiettivo sono spesso difficili, conseguenza di ciò è una fluorescenza non ottimale.
Un altra possibile configurazione in Fluorescenza diascopica è quella che include l'utilizzo di un condensatore a campo scuro (Darkfield condenser) nel percorso ottico. In questo caso lo specchio condensatore proietterà la luce sul campione ad angoli obliqui, impedendo alle lunghezze d'onda di eccitazione di entrare direttamente nell'obiettivo.
Nella Fluorescenza in campo chiaro è difficile separare la luce di eccitazione dalla luce fluorescente, perché entrambi i tipi di luce entrano direttamente nell'obiettivo.
Nella Fluorescenza in campo scuro i condensatori in campo chiaro vengono sostituiti da condensatori ad alta apertura numerica e ad immersione ad olio, questo tipo di condensatore dirige la luce di eccitazione a forte inclinazione verso il campione, e, a causa del disegno del condensatore in campo scuro, la maggior parte della luce di eccitazione non entra mai nell'obiettivo. Il campione assorbe la luce di eccitazione ed emette solo la luce a lunghezza d'onda maggiore, è questa luce che attraversa l'obiettivo e quindi passa attraverso il filtro di sbarramento per arrivare all'occhio dell'osservatore. L'immagine risultante è un oggetto più o meno intensamente fluorescente su un fondo scuro, ogni luce di eccitazione diffusa è bloccata dal filtro di sbarramento.

Anche se la Fluorescenza a campo oscuro in luce trasmessa presenta dei miglioramenti rispetto a quella in campo chiaro, la tecnica ha svantaggi significativi. L' alta apertura numerica degli obiettivi ad olio o ad acqua viene ridotta dall'utilizzo del diaframma ad iride al fine di evitare che la luce di eccitazione entri direttamente nell'obiettivo (con conseguente perdita di intensità della luce e risoluzione). La tecnica in campo oscuro a luce trasmessa esclude l'uso simultaneo della fluorescenza con microscopia di fase o microscopia differenziale Nomarski (DIC). Questo metodo comporta, inoltre, che la maggior parte della luce proveniente dalla sorgente di illuminazione non viene utilizzata, in quanto la luce di eccitazione irradia la maggior parte del campione al di fuori del campo di vista che si osserva, riducendo così la sua effiicienza.