www.fluorescencemicroscopy.it

Acquisizione di immagini

In ogni tecnica di microscopia - brightfield , DIC, fluorescenza…, i supporti ottici di registrazione da utilizzare devono essere accuratamente selezionati per offrire la migliore qualità dell'immagine possibile per l'applicazione. Questa selezione non è spesso banale, dal momento che il ricercatore deve tener conto di una miriade di variabili, la maggior parte dei quali si escludono a vicenda. Spesso, l'utilizzo di una variabile in un campo è positiva per un aspetto e negativa per un altro. Ad esempio, nella maggior parte delle situazioni concernenti la microscopia cellulare in vivo, il compito primario diventa il bilanciamento tra la salute delle cellule e la qualità dell'immagine, tenendo in considerazione fattori come la vitalità delle cellule, rapporto segnale rumore e risoluzione richiesta o la velocità di acquisizione. Le finalità e gli obiettivi del tipo di indagine dovrebbe determinare l'ordine di priorità di questi fattori.

Le scelte relative al supporto ottico di registrazione comprendono telecamere a colori CCD per catturare immagini in brightfield o per campioni contenenti più fluorocromi, telecamere a raggi infrarossi spesso utilizzate nella diagnostica per immagini in modalità DIC, telecamere CCD con sensore raffreddato per catturare segnali di basso livello come in fluorescenza, sensori ad alta risoluzione in bianco e nero per TIRF e altre tecniche e molti altri.

Pixel Shift e set di filtri multibanda

Quando si effettua una fotografia con esposizioni multiple o più immagini digitali di campioni marcati con fluorocromi diversi, utilizzando diversi filters-cube in un microscopio standard, ci saranno inevitabili cambiamenti di registrazione tra le esposizioni.

A questi cambiamenti contribuiscono i seguenti fattori :

• variabilità dei picchi nel filtro di emissione e nel filtro dicroico;
• variazioni di spessore e di allineamento del filtro dicroico;
• vibrazioni meccaniche che si verificano quando i filters-cube vengono cambiati.

Anche se per alcune applicazioni questi effetti possono essere ridotti a livelli accettabili, molte altre richiedono un design dei filters-cube più sofisticato e apparecchi ottici più complessi. La tabella 1 elenca alcuni metodi disponibili per le applicazioni che coinvolgono l'utilizzo di più indagini. Questi includono il set di filtri multibanda e varie configurazioni che utilizzano sia filtri multibanda che filtri a banda singola.

Metodi per applicazioni che utilizzano indagini multiple

Tutti questi metodi sono progettati per eliminare gli errori di registrazione di cui sopra. Il metodo 2 offre la possibilità di analizzare visivamente fino a tre colori contemporaneamente. (I metodi da 3 a 6 hanno anche essi questa possibilità se vengono aggiunti al set di filtri dei filtri multibanda.)